Pasukan saintis antarabangsa dari Amerika Syarikat, Perancis dan China telah mencipta bentuk kehidupan semi-sintetik. Walaupun usaha telah dilakukan untuk mendapatkan bakteria dengan DNA yang diubah, mikroorganisma berkembang biak dengan buruk, memerlukan keadaan pertumbuhan khas, dan akhirnya menyingkirkan modifikasi yang diperkenalkan ke dalamnya. "Lenta.ru" membicarakan karya baru di mana para penyelidik berjaya menyelesaikan masalah ini, setelah memperoleh makhluk yang sangat berbeza dari semua kehidupan semula jadi di Bumi.
Baru-baru ini, DNA semua organisma hidup di planet kita terdiri daripada empat jenis nukleotida yang mengandungi adenin (A), atau timin (T), atau guanin (G), atau sitosin ©. Rentetan daripada puluhan atau ratusan juta nukleotida membentuk kromosom yang berasingan. Gen yang terdapat pada kromosom pada dasarnya adalah urutan nukleotida panjang di mana urutan asid amino protein dikodkan. Gabungan tiga nukleotida berturut-turut (kodon atau triplet) sepadan dengan salah satu daripada 20 asid amino. Oleh itu, kehidupan menggunakan kod genetik tiga huruf (ATG, CGC, dan sebagainya) berdasarkan abjad empat huruf (A, C, T, G).
Apabila sel organisma memerlukan protein (polipeptida), gen yang mengekodinya dihidupkan. Yang terakhir dilampirkan pada enzim khas yang disebut RNA polymerase, yang, semasa proses transkripsi, mulai mengikuti urutan nukleotida dan membuat salinannya dalam bentuk molekul yang disebut messenger RNA (mRNA). RNA sangat mirip dengan DNA, tetapi bukannya timin, ia mengandungi uracil (U). Selepas itu, mRNA meninggalkan inti sel dan diarahkan ke ribosom, di mana, semasa proses terjemahan, ia berfungsi sebagai resipi untuk membuat rantai asid amino protein.
Para penyelidik memutuskan untuk mengubah kod genetik Escherichia coli dengan menambahkan dua "huruf" tambahan padanya. Faktanya ialah DNA dalam organisma hidup berganda, iaitu, ia dibentuk oleh dua rantai yang dipasangkan satu sama lain dengan ikatan pelengkap. Ikatan semacam itu terbentuk antara asas A-nukleotida dari satu helai dan asas T-nukleotida dari yang lain (sama, antara C dan G). Itulah sebabnya kedua-dua nukleotida sintetik baru mesti dapat saling berpasangan. Pilihan jatuh pada dNaM dan d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Makmal Rocky Mountain / NIAID / NIH
Sepasang nukleotida sintetik dimasukkan ke dalam plasmid - molekul DNA pekeliling dua helai yang mampu membiak secara terpisah dari genom bakteria yang lain. Mereka menggantikan sepasang nukleotida pelengkap A dan T, yang merupakan sebahagian daripada operon laktosa - sekumpulan gen yang memetabolisme gula laktosa, dan urutan DNA bukan pengekodan yang berkaitan dengannya. Nukleotida sintetik tidak termasuk dalam wilayah yang disalin oleh polimerase dalam mRNA.
Video promosi:
Mengapa saintis memutuskan untuk tidak memasukkan nukleotida sintetik secara langsung ke dalam gen, tetapi di sebelahnya? Hakikatnya adalah sangat sukar untuk mengubah gen dengan cara ini agar tetap berfungsi. Lagipun, untuk ini anda perlu mengikat kodon baru yang dihasilkan dengan sebarang asid amino. Untuk ini, pada gilirannya, perlu mengajar sel untuk menghasilkan pelbagai jenis RNA pengangkutan (tRNA), yang dapat mengenali kodon ini.
Molekul tRNA melakukan fungsi berikut. Mereka, seperti trak, membawa asid amino tertentu di satu hujung, mendekati mRNA di ribosom dan, pada gilirannya, mula memadankan kembar nukleotida di hujung yang lain dengan kodon. Sekiranya sesuai, asid amino dilucutkan dan dimasukkan ke dalam protein. Namun, jika tidak ada tRNA yang sesuai, protein tidak akan disintesis, yang boleh memberi kesan negatif terhadap daya maju sel. Oleh itu, dengan memperkenalkan nukleotida sintetik ke dalam gen, para saintis harus membuat gen yang menyandikan tRNA baru yang dapat mengenali kodon tiruan dan melampirkan asid amino yang betul ke polipeptida. Walau bagaimanapun, tugas penyelidik lebih mudah. Mereka perlu memastikan bahawa plasmid dengan nukleotida sintetik akan berjaya membiak dan diserahkan kepada organisma anak perempuan.
Plasmid digunakan untuk mengubah Escherichia coli
Imej: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Alam / Jabatan Kimia / Institut Penyelidikan Scripps
Plasmid ini, yang disebut pINF, diperkenalkan ke E. coli. Namun, untuk menyalinnya, perlu ada banyak nukleotida yang terdapat di dalam sel bakteria. Untuk tujuan ini, satu lagi plasmid, pCDF-1b, dimasukkan ke dalam E. coli. Ini mengandung gen untuk diatom Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, yang mengkode protein NTT, yang mengangkut nukleotida dari medium nutrien ke dalam sel.
Walau bagaimanapun, para saintis menghadapi sejumlah kesukaran. Pertama, protein Phaeodactylum tricornutum mempunyai kesan toksik pada sel E. coli. Semuanya kerana terdapatnya serpihan urutan asid amino, yang menjalankan fungsi isyarat. Terima kasih kepadanya, protein mengambil kedudukan yang betul dalam sel alga, selepas itu urutan dikeluarkan. E. coli tidak dapat mengeluarkan serpihan ini, oleh itu para penyelidik membantunya. Mereka berjaya mengeluarkan 65 asid amino pertama dari NTT. Ini mengurangkan ketoksikan dengan ketara, walaupun ia juga mengurangkan kadar pengangkutan nukleotida.
Masalah lain ialah nukleotida sintetik disimpan dalam plasmid untuk waktu yang lama, dan tidak diganti ketika DNA disalin. Ternyata, keselamatan mereka bergantung pada nukleotida yang mengelilingi mereka. Untuk mengetahui, para saintis menganalisis pelbagai kombinasi yang tertanam dalam 16 plasmid. Untuk mengetahui sekiranya nukleotida sintetik keluar dari urutannya, para penyelidik menggunakan teknologi CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Imej: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 adalah mekanisme molekul yang ada di dalam bakteria dan membolehkannya melawan bakteriofag. Dengan kata lain, teknologi ini mewakili kekebalan terhadap jangkitan virus. CRISPR adalah sekeping DNA khas. Mereka mengandungi serpihan virus DNA yang pernah menjangkiti nenek moyang bakteria masa kini, tetapi dikalahkan oleh pertahanan dalaman mereka.
Apabila bakteriofag memasuki bakteria, serpihan ini digunakan sebagai templat untuk sintesis molekul yang disebut crRNA. Banyak rantai RNA yang berbeza terbentuk, mereka mengikat protein Cas9, yang tugasnya adalah memotong DNA virus. Dia dapat melakukan ini hanya setelah crRNA menemui serpihan DNA virus pelengkap.
Sekiranya, sebagai ganti crRNA, urutan RNA yang melengkapi serpihan plasmid tertentu digunakan, maka Cas9 akan memotong plasmid juga. Tetapi jika terdapat nukleotida sintetik dalam serpihan itu, maka protein tidak akan berfungsi. Oleh itu, dengan menggunakan CRISPR, adalah mungkin untuk mengasingkan plasmid yang tahan terhadap mutasi yang tidak diingini. Ternyata dalam 13 daripada 16 plasmid, kehilangan nukleotida sintetik tidak signifikan.
Oleh itu, para penyelidik berjaya membuat organisma dengan perubahan mendasar dalam DNA, yang dapat mengekalkannya dalam dirinya selama-lamanya.
Walaupun bentuk kehidupan semi-sintetik hanya mempunyai dua nukleotida tidak wajar dalam genomnya, yang tidak terdapat dalam kodon dan tidak terlibat dalam pengekodan asid amino, ia adalah organisma tahan pertama yang abjad DNAnya terdiri daripada enam huruf. Pada masa akan datang, saintis kemungkinan besar akan dapat menggunakan inovasi ini untuk mensintesis protein, dengan itu membuat kod genetik tiruan yang lengkap.
Alexander Enikeev
