Sampel tisu mumi dengan nama "Maria" dan "Vavita" dihantar dari Peru ke makmal Rusia untuk penyelidikan. Sampel tisu biologi yang disediakan dikaji dengan menggunakan mikroskopi elektron pengimbasan, spektrum Raman, ICPE, komposisi bumi diatom (bahan di permukaan kulit mumia) telah diselidiki. Kajian DNA tisu yang dipindahkan juga dilakukan.
Penyediaan sampel
Sampel tisu 500 μg dipindahkan ke dalam tiub plastik dan dilarutkan dalam 1 ml buffer (10 mM Tris-HCl pH = 10.5, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl). Pada suspensi yang dihasilkan, Na dodecyl sulfate ditambahkan ke 0,5%, dipanaskan hingga +80 C, dan setelah 10 minit, proteinase K (hingga 500 μg / ml) ditempatkan dalam termostat (+55 C) selama 24 jam.
Deproteinisasi dilakukan dengan kaedah fenolik: menambahkan fenol dalam jumlah yang sama dengan suspensi, kemudian fenol: kloroform (1: 1), kloroform; selepas setiap penambahan, pengadukan berterusan dilakukan pada rotor sudut dan sentrifugasi pada 15 ribu rpm, 10 min.
Pada sedimen super yang diperoleh setelah sentrifugasi ke-3 ditambahkan 1/10 bahagian isipadu NaCl 1 M dan 2.5 isipadu etil alkohol dua kali suling, dan dibiarkan semalaman pada suhu -30 C dalam tabung uji kon - "Eppendorf". Sentrifugasi dilakukan pada 15 ribu vol. min. dalam masa 10 minit dan menerima DNA "diendapkan" dalam bentuk endapan coklat. Pelet DNA dibasuh dua kali dengan 70% etil alkohol dan dikeringkan pada suhu bilik (1 jam) dan kemudian dilarutkan dalam buffer TE.
PCR dilakukan pada pengendara terma yang dapat diprogram "My Cycler" ("Bio = Rad") menggunakan oligoprimer standard yang disintesis oleh kaedah fasa pepejal di persatuan "Beagler" (St. Petersburg). Campuran tindak balas untuk penguatan dengan isipadu 25 μL termasuk: 15 nM setiap oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 pada +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoethanol, 170 μg / ml BSA dan campuran empat dNTP asas pada kepekatan masing-masing 1,0 mM dan DNA termostabiliti polimerase Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Selepas denaturasi (10 min, 94 C), 35 kitaran penguat dilakukan untuk setiap sistem ujian: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Untuk mengawal kekhususan, sampel DNA dengan genotip yang diketahui untuk lokus yang dikaji (sistem penanda), serta sampel kawalan, dimasukkan ke dalam reaksi.mengandungi campuran reagen tanpa DNA. Selepas penguatan, penimbal pewarnaan ditambahkan ke dalam campuran campuran reaksi (7 μl) dan dipisahkan dengan elektroforesis menegak dalam gel poliakrilamida 6% (210x150x1 mm), diwarnai dengan etidium bromida dan difoto di bawah sinar ultraviolet. Untuk mengenal pasti alel, piawai alel yang sesuai dengan lokus ini ("tangga") digunakan.
Video promosi:
Analisis DNA
Untuk kajian ini, kami menggunakan kaedah analisis exome DNA manusia berdasarkan urutan throughput tinggi dengan pengayaan oleh hibridisasi.
Teknik analisis exome DNA manusia.
2 sampel dianalisis … Semua peringkat penyediaan sampel sebelum PCR dilakukan di bilik bersih. Penyediaan sampel, pengekstrakan DNA, dan penguatan serpihan DNA individu dilakukan di ruangan yang berlainan.
Penyesuai khusus (Kit Penyediaan Perpustakaan KAPA dan Kit Penyesuai SeqCap; Roche) dihubungkan ke hujung DNA terpecah genom (~ 5 ng), setelah itu pemilihan serpihan dua peringkat dalam julat panjang 200-350bp dilakukan dengan menggunakan Manik-manik AMPureXP (Beckman Coulter) … Fragmen yang dihasilkan diperkuat dengan primer khusus penyesuai dan di hibridisasi dengan probe spesifik biotinilasi (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) selama 28 jam pada 47 ° C. Dalam satu reaksi, dua sampel DNA digabungkan. Hibrida probe-DNA biotinilasi diasingkan dan dimurnikan dengan zarah-zarah magnet konjugasi streptovidin; penguatan kedua dan penilaian kualitatif dari perpustakaan DNA yang dihasilkan dilakukan (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Untuk menghilangkan serpihan penguat di luar sasaran dan dimer penyesuai, perpustakaan DNA disucikan semula menggunakan partikel magnetik AMPureXP Beads (Gambar 1). Kepekatan akhir perpustakaan yang disiapkan dinilai pada instrumen Quantus menggunakan kit Sistem QuantiFluor® dsDNA komersial (Promega). Perpustakaan DNA yang dihasilkan tidak bergerak ke permukaan sel aliran. Urutan dilakukan di platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycle). Perpustakaan DNA yang dihasilkan tidak bergerak ke permukaan sel aliran. Urutan dilakukan di platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycle). Perpustakaan DNA yang dihasilkan tidak bergerak ke permukaan sel aliran. Urutan dilakukan di platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycle).
Gambar: 1
Penilaian umum mengenai kualiti DNA yang dijujukan
Kaedah standard seperti program FastQC dan Ubur-ubur dan KraTER digunakan untuk penilaian kualiti awal. Penilaian kualiti tidak menunjukkan masalah kualiti dengan pembacaan DNA yang diuraikan untuk kedua-dua sampel. Gambar tidak ditunjukkan kerana tidak bermaklumat.
Untuk sampel pertama (selanjutnya M, mumia besar "Maria") bacaan 113.4M diuruskan, untuk sampel kedua (selanjutnya W, mumia kecil "WaWita") 22.9M bacaan diuraikan.
Langkah seterusnya adalah membersihkan bacaan yang disusun dari pelbagai urutan teknikal yang akan mengganggu analisis selanjutnya. Untuk ini, program Cookiecutter telah digunakan. Selepas pembersihan, terdapat 113.3M (99%) bacaan dan 22.8M (99%) bacaan, masing-masing, untuk M dan W.
Anggaran jumlah DNA kuno dan pemisahannya dari moden
Kaedah standard untuk menilai kehadiran dan jumlah DNA purba adalah dengan menganggarkan jumlah nukleotida yang rosak pada masa. Untuk ini, program MapDamage 2.0 telah digunakan. MapDamage 2.0 yang menunjukkan jumlah DNA kuno dalam 30.1%, tetapi kerana MapDamage menunjukkan bahawa kita menggunakan rujukan dekat, dan kita tidak tahu dengan tepat seberapa dekat kedua-dua sampel dengan genom manusia moden, dan kita menggunakan perpustakaan exome, kaedah ini sendiri tidak mencukupi. Kaedah lain yang baik untuk menilai DNA kuno adalah bilangan serpihan pendek.
Penapisan DNA purba yang dikatakan berlaku dalam tiga peringkat. Pada peringkat pertama, kami membuang semua bacaan berpasangan yang tidak dapat disilang dan dihimpunkan menjadi satu bacaan yang tidak berpasangan dengan pertindihan. Bacaan ini menunjukkan bahawa serpihan asal yang diuraikan lebih panjang daripada 300 bp. dan kemungkinan besar DNA moden. Oleh itu, selepas langkah ini, masing-masing 86.9% dan 91.8% kekal. Selepas itu, serpihan bertindih tunggal dipilih sehingga panjangnya lebih pendek daripada 150 bp, kerana inilah panjang yang kami harapkan untuk DNA kuno. Selepas langkah ini, 8.6% dan 38.5% masing-masing kekal untuk sampel M dan W. Harus diingat bahawa walaupun terdapat perbezaan peratusan, jumlah bacaan mutlak antara sampel M dan W sangat serupa: 9.8M dan 8.8M, yang dapat dijelaskan oleh fakta bahawa kandungan DNA kuno dalam kedua-dua sampel adalah serupa.
| Parameter | Contoh M (Maria) | Contoh W (Wawita) |
| Bilangan bacaan | 113.3M | 22.8M |
| Peratusan serpihan pendek <300 bp | 86.9% | 91.8% |
|
Peratusan serpihan pendek <150 bp (bilangan) |
8.6% (9.846.035) |
38.5% (8 813 220) |
|
Peratusan serpihan diselaraskan setiap genom manusia (bilangan) |
2.03% (2.345.084) |
9.65% (2.264.551) |
| Peratusan serpihan sejajar setiap genom manusia dari pendek <150 bp | 23.8% | 25.6% |
Memperoleh DNA yang serupa dengan genom manusia rujukan
DNA purba dugaan yang dihasilkan dipetakan ke genom manusia rujukan menggunakan saluran carian varian genomik standard menggunakan BWA, samtools, dan Wcftools.
Lebih-lebih lagi, hanya 23.8% sampel M dan 25.6% berjaya dipetakan ke genom rujukan manusia moden. Pada masa yang sama, untuk kedua-dua sampel, 75% bacaan yang diuraikan tidak dapat dipetakan ke genom manusia. Ini dapat dijelaskan oleh pencemaran dan fakta bahawa sampel ini terletak cukup jauh dari genom manusia moden. Pada masa yang sama, perlu diingat bahawa kita telah menyusun pustaka exome dan dengan itu meminimumkan pencemaran DNA bakteria.
Analisis pengintaian awal dari bacaan yang tidak dimasak menunjukkan bahawa beberapa dari mereka tergolong dalam DNA berulang khusus untuk ungulat, ini dapat dijelaskan oleh fakta bahawa lemak llama digunakan dalam mumifikasi.
Analisis yang lebih terperinci memerlukan kira-kira tiga minggu pengiraan, kerana penyelesaian yang ada dibuat hanya untuk genom virus dan bakteria, dan kita perlu membandingkan dengan semua genom yang ada, termasuk genom tumbuhan, untuk memahami spesies mana yang diuraikan.
Ciri-ciri pilihan yang dijumpai
Bacaan yang dipetakan digunakan untuk mencari varian yang membezakan sampel M dan W dari genom manusia moden, serta untuk menilai pencemaran bacaan dari kromosom Y manusia.
Soalan pertama yang perlu dijawab adalah kromosom yang dibaca secara berurutan.
Oleh kerana kita tahu bahawa sampel Maria diasingkan dari tulang dan otot, dan Vavita hanya dari tulang, kita menjangkakan perbezaan dalam jumlah mtDNA. Tetapi tidak ada banyak perbezaan.
Jumlah bacaan yang dipetakan pada Y adalah ujian lain untuk pencemaran oleh manusia moden. Menariknya, ternyata sama pada kedua-dua sampel.
Statistik untuk varian yang dijumpai ditunjukkan di bawah:
| Parameter | Contoh M (Maria) | Contoh W (Wawita) |
| Jumlah pilihan dijumpai | 79957 | 48941 |
| Bilangan pilihan pada Y | 534 | 541 |
| Jumlah pilihan yang boleh dipercayai (lebih daripada 20 bacaan dan lebih daripada 30 kualiti) | 16969 | 6181 |
| Varian dengan rsid yang diketahui (terdapat dalam pangkalan data snip) | 5701 | 3089 |
| Pilihan sah umum | 92 | |
| pilihan biasa dengan rsid | 49 |
Selepas itu, menjadi mungkin untuk menjawab soalan: adakah saudara M dan W? Jawapannya adalah tidak.
Hanya 49 varian yang sesuai didapati antara M dan W dan 3040 berbeza untuk varian dengan rsid yang diketahui. Lebih-lebih lagi, mungkin ini adalah pelbagai jenis atau subspesies seseorang atau makhluk yang tidak dikenali.
Menariknya, varian dengan kromosom Y sama untuk kedua-dua sampel, yang menunjukkan pencemaran oleh orang yang sama, dan bahawa dalam DNA kuno kromosom Y, mungkin masih belum ada kromosom.
Penilaian kesamaan dengan genom manusia berurutan yang ada dari 1000 Human Genome Project
Perhatikan bahawa ini hanya analisis perkiraan, kerana untuk analisis yang lebih tepat, varian diperlukan dari kawasan genom di bawah pemilihan neutral, dan kami memiliki data exome.
Walaupun demikian, dengan menggunakan 5708 varian untuk M atau 3096 untuk S, adalah mungkin untuk melakukan varian analisis dibandingkan dengan data 1000 genom manusia.
Hasil analisis PCA dalam gambar di bawah adalah hamparan dua gambar untuk M dan W, dikira secara berasingan, kerana terlalu sedikit pilihan umum antara M dan W untuk menganggarkan jarak antara M dan W.
Skor persamaan.
Seperti yang anda lihat, tidak ada kebetulan dengan kumpulan gen mana pun, ia juga berbeza antara satu sama lain. Tetapi harus diingat bahawa kita menggunakan urutan pengekodan di bawah pilihan, dan disarankan untuk menggunakan varian di bawah pilihan netral.
Walaupun begitu, hasil PCA sesuai dengan pengesahan varian manual, yang menunjukkan bahawa data berada dalam homozigot yang tidak dirujuk, yang sekali lagi menunjukkan bahawa gambar tersebut jauh dari genom manusia moden.
Kesimpulannya
Sayangnya, kami hanya terhad kepada dua sampel, biasanya dalam analisis jenis ini lebih banyak digunakan, sekurang-kurangnya 3-10 sekurang-kurangnya ada kaitannya. Oleh itu, adalah perlu untuk meneruskan penyelidikan dengan sebilangan besar sampel.
Pada masa yang sama, kemungkinan besar kita dapat menyimpulkan bahawa sampel DNA Mary dan Vavita sesuai dengan DNA manusia, tetapi tidak bertepatan dengan DNA yang tersedia untuk kita dari pangkalan data 1000 orang.
Pengarang laporan: Baranov V. S. dan Aseev M. V. (Institut Penyelidikan Ilmiah Obstetrik dan Ginekologi, Jabatan Diagnostik Pranatal), Glotov A. S. dan Glotov O. S. (Universiti Negeri St. Petersburg), A. S. Komissarov (Institut Sitologi, Akademi Sains Rusia, Pusat Bioinformatik Genetik).
Bahan yang disediakan oleh Konstantin Georgievich Korotkov (Doktor Sains Teknikal, Profesor, Universiti Teknologi Maklumat, Mekanik dan Optik) dan Dmitry Vladislavovich Galetsky (Calon Sains Perubatan, I. P. Pavlov Pertama Universiti Perubatan Negeri St. Petersburg).
Untuk maklumat lanjut mengenai mumia Nazca, lihat teg: Mumia Nazca.
