Para saintis mempunyai harapan tinggi untuk teknologi CRISPR / Cas9, yang memungkinkan perubahan ketepatan tinggi dalam genom organisma hidup, termasuk manusia. Semua artikel ilmiah baru diterbitkan menerangkan pelbagai jenis sistem CRISPR, serta pengubahsuaiannya. "Lenta.ru" membincangkan penemuan di kawasan ini, yang dibuat pada tahun 2016.
Ribuan dari mereka
CRISPR / Cas9 adalah sistem imuniti penyesuaian bakteria yang membolehkan mikroorganisma melawan virus. Ia terdiri daripada spacer - bahagian DNA yang sesuai dengan serpihan tertentu (protospacer) DNA agen berjangkit. Spacer mengekodkan molekul crRNA tertentu yang mengikat enzim Cas9. Kompleks yang dihasilkan melekat pada rantai DNA virus, dan Cas9 berfungsi seperti gunting, memotongnya.
Sebenarnya, CRISPR / Cas9 adalah salah satu daripada banyak sistem serupa yang dimiliki bakteria dan archaea. Para saintis membahagikannya kepada dua kelas. Kelas pertama merangkumi sistem CRISPR jenis I, III, dan IV, dan yang kedua - II dan V. Jenis II mengandungi protein Cas9 yang terlibat dalam pemerolehan spacer baru, pengumpulan crRNA dalam sel, dan pembelahan DNA. Dalam sistem lain, kompleks multi-protein digunakan untuk tujuan ini. Ini menjadikan jenis II jenis sistem CRISPR termudah yang sesuai untuk keperluan kejuruteraan genetik.
Jenis boleh, pada gilirannya, dibahagikan kepada subtipe bergantung kepada gen tambahan yang dikaitkan dengan CRISPR. Sebagai contoh, sistem IIA mengandungi gen csn2, yang menyandikan protein yang mengikat DNA dan terlibat dalam pemerolehan spacer. Dalam sistem IIB, csn2 tidak ada, tetapi ada gen cas4, yang fungsinya masih belum diketahui, dan sistem IIC tidak memiliki csn2 atau cas4.
Khazanah di dalam bakteria
Video promosi:
Semua sistem CRISPR yang diketahui telah dijumpai oleh saintis dalam bakteria yang ditanam dalam keadaan makmal. Walau bagaimanapun, terdapat sebilangan besar mikroorganisma yang tidak dikultivasi, yang merangkumi arkea dan bakteria. Mereka biasanya hidup dalam keadaan yang teruk - mata air mineral atau badan air beracun di lombong yang terbengkalai. Walau bagaimanapun, para penyelidik dapat mengasingkan DNA dari mereka dan mengenal pasti kawasan tertentu di dalamnya. Dalam makalah baru yang diterbitkan di Nature pada 22 Disember, ahli genetik di University of California, Berkeley menyahkod genom dari komuniti mikroba semula jadi, menemui variasi lain dari sistem CRISPR.
Bacteriophage - virus yang menjangkiti bakteria
Gambar: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Para saintis berjaya mengetahui bahawa beberapa jenis nanoorganisme ARMAN seperti arche yang sedikit dipelajari juga memiliki CRISPR / Cas9, walaupun sebelumnya dipercayai hanya bakteria yang memilikinya. Telah diperhatikan bahawa sistem ini menempati tempat perantaraan antara subtipe IIC dan IIB dan dapat berfungsi sebagai pertahanan terhadap gen "melompat" parasit (transposon) yang memasuki mikroorganisma dari archaea lain. Percubaan untuk menghasilkan semula aktiviti arkeologi CRISPR / Cas9 di E. coli (Escherichia coli) tidak membawa apa-apa, yang menunjukkan adanya beberapa mekanisme khusus tambahan yang mengatur sistem ini.
Jenis sistem baru dalam kelas kedua, CRISPR / CasX dan CRISPR / CasY, juga dikenal pasti dari bakteria yang hidup di air bawah tanah dan sedimen. Sistem CRISPR / CasX merangkumi protein Cas1, Cas2, Cas4 dan CasX. Yang terakhir, seperti yang ditunjukkan oleh eksperimen pada E. coli, dibezakan oleh aktiviti nuclease, iaitu, ia mampu membelah DNA asing seperti Cas9. Walau bagaimanapun, ini berlaku hanya jika urutan TTCN berada di hadapan protospacer, di mana N adalah salah satu daripada empat nukleotida. Urutan seperti itu disebut PAM (motif bersebelahan protospacer - motif bersebelahan dengan protospacer). Sistem CRISPR / Cas9 juga mempunyai PAM - NGG tersendiri, yang seharusnya terletak setelah protospacer. Di samping itu, CRISPR / CasY dapat memotong DNA sekiranya terdapat urutan TA PAM berhampiran lokasi sasaran.
Apakah janji penemuan ini? Faktanya ialah sistem yang dikesan adalah yang paling ringkas yang diketahui ketika ini. Menurut saintis, sejumlah kecil protein yang diperlukan untuk kerja mereka menjadikan CRISPR / CasX dan CRISPR / CasY alat yang mudah untuk penyuntingan DNA. Selain itu, penyelidikan metagenomik, di mana DNA yang diperoleh dari persekitaran dikaji, akan mendedahkan jenis sistem CRISPR lain yang berguna untuk kejuruteraan genetik.
Jalan menuju kecemerlangan
Sudah tentu, ada alternatif untuk mencari sistem CRISPR secara semula jadi - peningkatan teknologi CRISPR / Cas9 yang sudah ada. Walaupun ketepatannya tinggi, dia membuat kesilapan dengan memotong DNA di tempat yang salah. Ini menyukarkan perubahan gen yang betul dan dengan itu dapat merawat penyakit keturunan secara berkesan. Oleh itu, saintis mencari kaedah untuk meningkatkan prestasi sistem. Pada tahun 2016, terdapat banyak karya ilmiah yang dikhaskan untuk mengubah CRISPR dan mengubahnya menjadi pelbagai alat gen.
Protein Cas9 dan crRNA - komponen utama sistem CRISPR
Imej: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Oleh itu, pada 8 Disember, jurnal Cell menerbitkan artikel oleh saintis dari University of Toronto, yang mencipta "anti-CRISPR" - sistem yang mematikan mekanisme dalam keadaan tertentu. Ini memungkinkan untuk menekan aktiviti Cas9 jika panduan RNA mengikat pada pecahan yang salah dan mencegah kesalahan. Anti-CRISPR terdiri daripada tiga protein penghambat nuclease. Secara semula jadi, pada mulanya ia tidak diciptakan oleh saintis, tetapi oleh virus, yang dengan demikian meneutralkan kekebalan bakteria.
Pada bulan Jun, para penyelidik Amerika, bersama rakan-rakan dari Rusia, mengesahkan bahawa sistem CRISPR / C2c2, yang diperoleh dari fusobacterium Leptotrichia shahii, mampu memotong RNA untai tunggal. Akibatnya, sistem CRISPR dapat digunakan untuk merobohkan - menekan fungsi - messenger RNA, yang membawa maklumat dari gen ke ribosom, di mana protein disintesis berdasarkannya.
Pada bulan Mei, para penyelidik di University of California mencipta CRISPR-EZ, sebuah teknologi yang membolehkan molekul DNA baru dimasukkan ke dalam genom embrio tikus dengan kejayaan hampir 100%. Sistem CRISPR / Cas9 disuntikkan ke telur binatang yang disenyawakan menggunakan jarum mikroskopik dan sedikit pelepasan elektrik. Dalam eksperimen mereka, saintis berjaya memperkenalkan mutasi pada gen pada 88 peratus tikus. Ini melebihi jumlah tikus yang diubahsuai secara genetik yang dihasilkan oleh penyuntingan CRISPR, yang menggunakan suntikan konvensional.
Pada bulan April, dengan menggunakan varian Cas9 yang tidak mempunyai aktiviti nuclease, ahli biologi molekul di University of Massachusetts School of Medicine mengembangkan teknologi CRISPRainbow. Panduan RNA, yang menunjukkan di mana enzim melekat, mengandungi label pendarfluor, yang memungkinkan, misalnya, untuk mengesan pergerakan elemen genetik bergerak.
Nyamuk Anopheles mungkin menjadi mangsa pertama sistem CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Dunia baru
Para saintis sudah menggunakan sistem CRISPR untuk membuat organisma yang diubah secara genetik, seperti nyamuk malaria, yang menyebarkan gen berbahaya di kalangan saudara liar mereka. Kaedah ini dipanggil pemacu gen. Sekiranya salah seorang ibu bapa individu adalah pembawa gen mutan, maka dia akan menyebarkannya kepada keturunannya dengan kebarangkalian 50 persen. Ini kerana ibu bapa mempunyai dua salinan gen, dan hanya satu daripadanya yang rosak. CRISPR dapat menyalin fragmen mutan dan memasukkannya ke dalam gen yang sihat. Hasilnya, keturunan mendapat mutasi dengan kebarangkalian 100%.
Pada tahun 2016, pakar dari Jawatankuasa Penasihat DNA Rekombinan (RAC) meluluskan permohonan dari University of Pennsylvania untuk melakukan ujian pengubahsuaian genetik manusia menggunakan teknologi CRISPR / Cas9.
Namun, mereka ditimpa oleh orang Cina. Pada bulan November, jurnal Nature melaporkan bahawa saintis China untuk pertama kalinya memperkenalkan sel dengan gen yang dimodifikasi oleh sistem CRISPR / Cas9 ke dalam manusia. Para penyelidik mengekstrak sel imun (limfosit T) dari darah pesakit dengan barah paru-paru metastatik dan kemudian menggunakan teknologi CRISPR untuk mematikan gen yang mengekodkan protein PD-1. Yang terakhir ini terbukti dapat menekan imuniti dengan mendorong pertumbuhan tumor. Para saintis mengusahakan sel yang diedit, meningkatkan jumlahnya, dan kemudian menyuntikkannya kembali ke dalam tubuh manusia. Adakah terapi gen akan mengatasi penyakit ini masih belum dapat dilihat.
Sistem CRISPR juga dapat digunakan untuk memerangi HIV dan penyakit keturunan manusia. Walau bagaimanapun, penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan rawatan yang berkesan. Sudah tentu, kita tidak membicarakan mutan, seperti dalam filem fiksyen ilmiah, tetapi saintis dapat dengan cepat membuat organisme yang diubah secara genetik, seperti tanaman pertanian yang tahan terhadap parasit. Masih perlu dilihat mengapa para saintis yang menemui CRISPR dan mengetahui bagaimana ia dapat digunakan belum memenangi Hadiah Nobel.
Alexander Enikeev
