Kejuruteraan genetik membuka peluang kepada manusia untuk mencipta organisma yang sebelumnya tidak ada dan untuk memusnahkan penyakit genetik. Walau bagaimanapun, perkara tidak begitu cerah, kerana teknologi CRISPR / Cas9 terobosan jauh dari sempurna. Kesalahan yang dia buat mungkin jarang berlaku, tetapi satu kesalahan itu cukup untuk membawa maut kepada seseorang. Lenta.ru bercakap mengenai apa yang salah dengan CRISPR dan bagaimana para saintis berusaha memperbaiki keadaan.
Sistem CRISPR / Cas9 - sejenis gunting DNA - dianggap sebagai revolusi dalam bidang kejuruteraan genetik. Dengan pertolongannya, saintis dapat mengedit genom manusia, menghilangkan mutasi berbahaya dari itu, dan dengan itu merawat penyakit keturunan yang tidak menyenangkan dan mematikan. Namun, seseorang tidak boleh berfikir bahawa sebelumnya tidak ada kaedah seperti itu. Di gudang genetik, misalnya, nuklease yang mengandung "jari" seng, dan endonuklease - enzim yang memecahkan molekul DNA di tempat-tempat tertentu. Dari segi ketepatan, fleksibiliti dan kos, ia jauh lebih rendah daripada CRISPR / Cas9, walaupun yang terakhir jauh dari sempurna.
CRISPR / Cas9 pada mulanya diciptakan bukan oleh saintis, tetapi oleh alam. Ini adalah mekanisme molekul di dalam bakteria yang memungkinkan mereka melawan bakteriofag dan parasit lain. Sebenarnya, ia berfungsi sebagai imuniti terhadap jangkitan. CRISPR (singkatan dari "pengulangan palindromik pendek, yang jaraknya secara berkala dalam kumpulan") adalah kawasan khas (lokus) DNA. Mereka mengandungi serpihan virus DNA yang pernah menjangkiti nenek moyang bakteria masa kini, tetapi dikalahkan oleh pertahanan dalaman mereka. Potongan-potongan ini disebut spacer dan dipisahkan antara satu sama lain dengan mengulangi urutan.
Apabila bacteriophage menyerang bakteria, setiap urutan berulang dan spacer bersebelahan digunakan sebagai templat untuk sintesis molekul yang disebut crRNA. Banyak rantai RNA yang berbeza terbentuk, mereka mengikat protein Cas9, yang tugasnya sangat mudah: memotong DNA virus. Namun, dia akan dapat melakukan ini hanya setelah crRNA menemui serpihan DNA virus yang saling melengkapi. Selepas Cas9 memecah asid nukleik asing, yang terakhir dimusnahkan sepenuhnya oleh nuklease lain.
CRISPR / Cas9 baik untuk ketepatannya, kerana untuk bakteria fungsi sistem kekebalan tubuh yang betul adalah masalah hidup dan mati. Sistem "anti-virus" perlu mencari bahagian DNA virus di antara sejuta yang lain dan, yang paling penting, tidak membingungkannya dengan genomnya sendiri. Selama berjuta-juta tahun evolusi, bakteria telah menyempurnakan mekanisme ini. Jadi setelah mereka mengetahui mengapa sistem CRISPR diperlukan, mereka menyedari bahawa ia dapat dijinakkan sebagai alat penyuntingan gen yang belum pernah terjadi sebelumnya.
Untuk mengganti satu kawasan tertentu dalam genom dengan yang lain, perlu mensintesis RNA panduan, yang pada dasarnya mirip dengan crRNA. Dia memberitahu Cas9 di mana perlu dilakukan pemecahan dua helai dalam DNA organisma yang diubah. Walau bagaimanapun, kita tidak perlu merosakkan gen, tetapi mengubahnya - sebagai contoh, ganti satu atau lebih nukleotida dan hilangkan mutasi berbahaya. Di sini alam kembali menyelamatkan. Mekanisme pembaikan semula jadi segera mula memulihkan rantai pemotongan. Caranya adalah untuk ini, beberapa serpihan RNA dikeluarkan berhampiran waktu rehat, selepas itu urutan serupa dimasukkan di sana. Para saintis dapat menggantikannya dengan urutan DNA mereka sendiri dan dengan itu mengubah genom.
Perwakilan skematik CRISPR
Video promosi:
Imej: Kaidor / Wikipedia
Walau bagaimanapun, tidak ada yang sempurna. Walaupun ketepatannya relatif, CRISPR kadang-kadang melakukan kesilapan. Salah satu sebabnya terletak pada sifat sistem. Merugikan bakteria untuk crRNA bertepatan 100 peratus dengan serpihan DNA virus, yang mungkin berbeza dengan satu atau dua nukleotida. Lebih baik baginya beberapa nukleotida mungkin berbeza, yang memberi mikroorganisma peluang yang lebih baik untuk melawan jangkitan. Pada masa yang sama, dalam kejuruteraan genetik, kekhususan rendah mengancam kesilapan: perubahan dapat dilakukan di tempat yang salah. Sekiranya ini berlaku semasa percubaan pada tikus, maka tidak akan ada tragedi khusus, tetapi penyuntingan genom manusia dapat berubah menjadi bencana.
Ini menjelaskan keprihatinan para saintis Barat mengenai eksperimen yang sedang dijalankan di China. Penyelidik Asia telah menggunakan teknologi CRISPR untuk mengubah genetik manusia secara genetik. Eksperimen seperti ini telah dilarang di Eropah dan Amerika Syarikat, tetapi baru-baru ini UK membenarkannya - hanya untuk tujuan penyelidikan. Embrio seperti itu harus dihancurkan dalam beberapa minggu setelah menerima, yang tidak termasuk "pembiakan" orang GM.
Namun, CRISPR / Cas9 tidak akan begitu hebat sekiranya tidak dapat ditingkatkan. Oleh itu, para saintis mengajar Cas9 untuk tidak memotong dua rantai sekaligus, tetapi hanya satu. Potongan dibuat di dua tempat yang berlainan dalam urutan DNA pada helai yang berbeza, jadi sistem mesti dapat mengenali nukleotida dua kali lebih banyak dari biasa, menjadikannya lebih tepat.
Protein Cas dan crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Para saintis di University of Western Ontario telah menemui cara lain untuk meningkatkan teknologi ini. Mereka berusaha menyelesaikan masalah memperbaiki DNA yang telah dipotong. Pemulihan cepat rantai asid nukleik membawa kepada fakta bahawa saintis tidak mempunyai masa untuk membuat pembetulan mereka sendiri terhadap genom. Oleh itu, lingkaran setan diciptakan: rantai, yang diperbaiki dengan cara yang tidak diingini, harus dipotong lagi dengan protein Cas9.
Untuk mengelakkan ini berlaku, para penyelidik mengubah gunting protein untuk membuat protein TevCas9. Ia memotong helai DNA di dua tempat, sehingga sukar untuk memperbaiki laman web ini. Untuk mensintesis enzim baru, enzim I-Tevl ditambahkan ke Cas 9, yang juga merupakan endonuklease, iaitu protein yang memecah molekul DNA di tengah, dan bukannya memotong ujung urutan, seperti yang dilakukan oleh eksonuklease. Protein pelakuran yang dihasilkan ternyata lebih tepat dalam mengikat ke laman web tertentu dan cenderung tidak melakukan kesalahan dan memotong laman web yang salah.
Struktur kristal Cas9 terikat dengan DNA
Foto: Projek wiki Cas9 / Wikipedia
Terdapat cara lain untuk meningkatkan ketepatan sistem CRISPR. "Perlumbaan senjata" antara bakteria dan virus tidak hanya mendorong pengembangan sistem pertahanan dalam mikroorganisma, tetapi juga cara meneutralkannya. Oleh itu, bakteriofag bermutasi dengan cepat, kehilangan kawasan di mana imuniti bakteria mengenalinya. Walau bagaimanapun, beberapa kod untuk protein anti-CRISPR, mengganggu kerja kompleks crRNA-Cas9.
Pada 8 Disember, jurnal Cell menerbitkan artikel oleh saintis dari University of Toronto yang mencipta "anti-CRISPR" - sistem yang membolehkan anda mematikan mekanisme dalam keadaan tertentu. Ia mencegah kesilapan yang tidak diingini dengan menekan aktiviti Cas9 sekiranya panduan RNA terikat pada pecahan yang salah. Anti-CRISPR terdiri daripada tiga protein yang menghalang nuclease dan dikodekan oleh gen salah satu virus bakteria.
Sudah, teknologi CRISPR digunakan untuk mengobati penyakit serius seperti leukemia dan barah paru-paru, dan juga sedang diuji untuk membersihkan sel-sel imun dari HIV. Oleh kerana para saintis mencari kaedah baru untuk memperbaiki kaedah ini, semakin banyak kemungkinan penerapannya akan terbuka.
Alexander Enikeev
